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Mediator Probe PCR

 

Technologie

 

Die Mediatorsonden PCR (engl. Mediator Probe PCR) ist ein innovatives und leistungsstarkes real-time PCR Verfahren, welches eine hoch selektive, sensitive und quantitative Detektion von Nukleinsäuren ermöglicht. Die Mediator Probe PCR nutzt hierbei markierungsfreie Mediatorsonden (engl. Mediator Probes) für die DNA-Detektion und universelle Reporter Moleküle (engl. Universal Reporter) für die Generierung eines Fluoreszenzsignals.

MP PCR Abb1

 

Abbildung 1: Reaktionsmechanismus der Mediator Probe PCR. In diesem Verfahren sind DNA-Detektion über Mediatorsonden (A-B) und die Fluoreszenzsignalgenerierung mittels Universal Reporter (C – E) zwei unterschiedliche, voneinander getrennte Schritte.1

 


Vorteile

 

Da bei der Mediator Probe PCR DNA-Detektion und Signalgenerierung zwei unterschiedliche Prozesse sind, können beide Schritte unabhängig voneinander optimiert werden. Dies führt zu mehreren Vorteilen und innovativen Anwendungen der Technologie:

 

1) Optimierte fluorogene Universal Reporter Strukturen mit einem hohen Verhältnis zwischen Fluoreszenzsignal und Hintergrundrauschen

Bei der Mediator Probe PCR werden für die Fluoreszenzsignalgenerierung Zielsequenz-unabhängige Universal Reporter eingesetzt. Durch die Verwendung des Mediator Extension Assays kann das Verhältnis Fluoreszenzsignal zu Hintergrundrauschen, unabhängig von einem real-time PCR System, für diese Art von Molekülen optimiert werden.1 Nachdem dies einmal geschehen ist wird der optimierte Universal Reporter die real-time PCR Ergebnisse sämtlicher Assays verbessern, in welchen er eingesetzt wird.

 

MP PCR Abb2

 

 Abbildung 2: Optimierte Sekundärstruktur eines Universal Reporters, welche über OligoPAD simuliert wurde.1

 

 

2) Ein Standardset an Universal Reportern für unterschiedliche mulitplex-real-time PCRs

Bei der multiplex Mediator Probe PCR kann standardmäßig ein Set an optimierten Universal Reportern für die Signalgenerierung eingesetzt werden. Zu diesem Zweck besitzt jeder Universal Reporter-Typ eine spezifische Mediatorbindestelle und ist durch ein unterschiedliches Fluorophor markiert. Hierdurch kann die Spaltung einer Mediatorsonde in Gegenwart der entsprechenden DNA-Zielsequenz nachgewiesen werden. Durch den Austausch der eingesetzten markierungsfreien Primer und Mediatorsonden kann dieses Standardset direkt an unterschiedliche DNA-Zielsequenzen angepasst werden.

 

 

MP PCR Abb3 

Abbildung 3: Da fluorogene Universal Reporter unabhängig von der DNA-Zielsequenz sind kann ein Standardset eingesetzt werden, um viele verschiedene Sets an DNA-Zielsequenzen zu detektieren.2

 

 

3) Markierungsfreie Mediatorsonden mit klaren Richtlinien zum Sequenzdesign

Da Universal Reporter eingesetzt werden um Fluoreszenzsignale zu generieren, tragen Mediatorsonden keinerlei Fluoreszenzmarkierungen. Somit wird das Design einer Mediatorsonde nicht durch die Eigenschaften einer DNA-Zielsequenz beeinflusst, wie beispielsweise GC-Quenching oder möglichst kurze Hybridisierungsabschnitte. Hierdurch konnten wir klare Richtlinien für das Sequenzdesign von Mediatorsonden ausarbeiten.3 Diese Richtlinien sind von allgemeiner Gültigkeit und sollten bei jeder Mediator Probe PCR berücksichtigt werden, um ein maximales Ergebnisse zu erzielen.

 

MP PCR Abb4

 

Abbildung 4: Die Bindungsenergien einer Mediatorsonde haben einen signifikanten Einfluss auf das Assay-Ergebnis. Daher sollte die Bindung zwischen Mediatorsonde und Zielsequenz ca. -18 kcal mol-1 betragen (links) und zwischen Mediatorsonden und Universal Reporter ca. -10 kcal mol-1 (rechts). Wir empfehlen den Einsatz einer geeigneten bioinformatischen Software um die Bindungsenergien zu berechnen und die Sekundärstrukturen vorherzusagen.

 

MP PCR Abb5


Abbildung 5: Mechanismus der Mediatorsonden-Spaltung. Während der DNA-Amplifikation wird die Mediator Probe durch die Polymerase gespalten. Die Spaltung erfolgt hierbei am 3´-Ende des Mediators nach der letzten Base, welche noch an die Zielsequenz bindet.

 

 

Die Mediator Probe PCR nutzen

 

Die Mediator Probe PCR ist durch das Patent / die Patentanmeldungen basierend auf den Publikationen der Patentfamilie WO2013079307 (Bifunctional oligonucleotide probe for universal real-time multianalyte detection) geschützt.

 

 

Publikationen

 

  1. Lehnert M, Kipf E, Schlenker F, Borst N, Zengerle R, von Stetten F.; "Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides". Anal. Methods. 2018;10:190. doi: 10.1039/C8AY00812D. 
  2. Wadle S, Lehnert M, Schuler F et al.; "Simplified development of multiplex real-time PCR through master mix augmented by universal fluorogenic reporters". BioTechniques. 2016;61(3):123–8. doi: 10.2144/000114443.
  3. Wadle S, Lehnert M, Rubenwolf S, Zengerle R, Stetten F von; "Real-time PCR probe optimization using design of experiments approach". Biomolecular detection and quantification. 2016;7:1–8. doi: 10.1016/j.bdq.2015.12.002.
  4. Wadle S, Rubenwolf S, Lehnert M et al.; "Mediator probe PCR: detection of real-time PCR by label-free probes and a universal fluorogenic reporter". Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2014;1160:55–73. doi: 10.1007/978-1-4939-0733-5_6.
  5. Faltin B, Wadle S, Roth G, Zengerle R, Stetten F von; "Mediator probe PCR: a novel approach for detection of real-time PCR based on label-free primary probes and standardized secondary universal fluorogenic reporters". Clinical chemistry. 2012;58(11):1546–56. doi: 10.1373/clinchem.2012.186734

 

 

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